Просим откликнутся тех, кто занимается выращиванием хлореллы или спирулины.

Определение концентрации глюкозы в крови

Аватар пользователя
Ansaraides
NaviGator
NaviGator
Сообщений: 4792
Зарегистрирован: 09 июл 2013, 08:07
Награды: 8
Откуда: Правь
Пол: Мужской
:
Замок
Благодарил (а): 1386 раза
Поблагодарили: 2638 раза

Определение концентрации глюкозы в крови

Сообщение Ansaraides » 27 фев 2017, 09:37

.
Все очень просто! По Гиппократу - пища это лекарство. Но не можем же мы постоянно принимать лекарства!
"Есть или не есть и что есть из того, что есть?"
Если ты поднялся на вершину горы и тебе некуда идти - иди дальше!

Нажимай на значок "пальца" в верхнем правом углу и спи крепко.

Аватар пользователя
Ansaraides
NaviGator
NaviGator
Сообщений: 4792
Зарегистрирован: 09 июл 2013, 08:07
Награды: 8
Откуда: Правь
Пол: Мужской
:
Замок
Благодарил (а): 1386 раза
Поблагодарили: 2638 раза

Re: Определение концентрации глюкозы в крови

Сообщение Ansaraides » 27 фев 2017, 09:50

Принцип глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляет­ся кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин образованием окрашенного соедине­ния, интенсивность окраски которого пропорциональна содержа­нию глюкозы. Данный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

Необходимые реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, раст­воряя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодиль­нике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имею­щийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить не­сколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начи­нает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточ­но чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предваритель­но высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раство­ра (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Ход определения глюкозы глюкозооксидазным методом

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гид­рата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровоч­ного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифуги­руют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реак­тива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно умень­шается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного гра­фика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калиб­ровочному графику, для построения которого на одной оси откла­дывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величи­ну экстинкции.
Примечания к методика определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотониче­ский раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфа­та цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно еже­дневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

Для просмотра ссылок Вы должны быть авторизованы на форуме.
Для просмотра ссылок Вы должны быть авторизованы на форуме.
Все очень просто! По Гиппократу - пища это лекарство. Но не можем же мы постоянно принимать лекарства!
"Есть или не есть и что есть из того, что есть?"
Если ты поднялся на вершину горы и тебе некуда идти - иди дальше!

Нажимай на значок "пальца" в верхнем правом углу и спи крепко.

Аватар пользователя
Ansaraides
NaviGator
NaviGator
Сообщений: 4792
Зарегистрирован: 09 июл 2013, 08:07
Награды: 8
Откуда: Правь
Пол: Мужской
:
Замок
Благодарил (а): 1386 раза
Поблагодарили: 2638 раза

Re: Определение концентрации глюкозы в крови

Сообщение Ansaraides » 13 ноя 2018, 03:38

Способ определения глюкозы в ротовой жидкости

Авторы патента:
Смирнова Татьяна Ивановна (RU)
Каргаполов Александр Васильевич (RU)
Битюкова Елена Владимировна (RU)
Рощина Ирина Александровна (RU)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)


Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)

Изобретение относится к медицине, к области лабораторной диагностики. Сущность способа: к 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2N раствора КОН и 3 капли 0,1% раствора метиленового синего; содержимое перемешивают встряхиванием и нагревают на водяной бане до 80°С. При сохранении синей окраски индикатора делают вывод о том, что содержание глюкозы в ротовой жидкости соответствует норме и не превышает 0,12%; при полном исчезновении синей окраски индикатора - о превышении нормального значения содержания глюкозы. Способ доступен и прост в исполнении. Использование способа позволяет в короткие сроки определить повышенное содержание глюкозы (>0,12%) в пробе ротовой жидкости объемом 1 мл.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и биоорганической химии.

Глюкоза в организмах человека и животных - основной представитель углеводов, входящий в состав важнейших биологических жидкостей: крови, мочи, слюны.

В клинической практике для диагностики патологических состояний используются результаты анализов крови и мочи «на сахар», т.е. содержание глюкозы.

Содержание глюкозы в крови здорового человека колеблется от 0,8 до 1,2 г/л [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М., Медицина. 1976 г. с.138]. При некоторых заболеваниях содержание сахара в крови возрастает (гипергликемия) и может достигать в тяжелых случаях 50-80 г/л. Параллельно увеличивается содержание глюкозы в ротовой жидкости [Денисов А.Б. Слюнные железы. Слюна. М., Изд. РАМН, 2005 г. с.53] и сахар обнаруживается в моче. Понижение содержания сахара в крови (гипогликемия) наблюдается реже и связано с нарушением функций печени и поджелудочной железы.

Методы определения глюкозы в водных растворах и крови человека весьма многочисленны [Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Справочник в двух томах. Том II, с.10] и делятся на ферментативные и неферментативные.

Аналогом заявленного способа авторы предлагают наиболее распространенный ферментативный метод определения глюкозы в крови с помощью препарата, содержащего ферменты, глюкозооксидазу и пероксидазу (по В.К.Городецкому) [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М.: Медицина, 1976 г. с.141], отличается высокой специфичностью, но позволяет определять глюкозу в исследуемой жидкости только при содержании от 0,2 до 4,0 г/л. Он включает 3 ступени биохимических превращений и 4- чисто химическую: окисление о-толуидина с последующим фотоколориметрическим определением окисленной формы красителя методом калибровочного графика.

Использование четырехступенчатой цепочки превращений с применением рабочего раствора, содержащего два ферментативных препарата, усложняет технику выполнения анализа и увеличивает вероятность ошибки эксперимента. Нельзя не отметить, что применение в лабораторной практике ароматического амина о-толуидина влечет за собой опасность канцерогенеза.

Прототипом заявленного способа авторы считают неферментативное определение глюкозы по Хагедорну-Иенсену в безбелковом фильтрате крови [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М., Медицина, 1976 г. с.138]. Метод основан на восстановлении железа (III) в составе гексацианоферрата (III) калия (красной кровяной соли) до железа (II) с получением желтой кровяной соли K4[Fe(CN)6] при нагревании в щелочной среде Избыток красной кровяной соли определяется иодометрическим титрованием. Свободный иод, выделившийся в количестве, эквивалентном избытку K3[Fe(CN)6], оттитровывается раствором Na2S2O3.

Определение сахара производят в безбелковом фильтрате крови, поэтому необходимо предварительно осадить белки крови. Для этого берут 2 пронумерованные пробирки, в каждую из них наливают из бюретки по 5 мл 0,45% раствора сернокислого цинка и по 1 мл 0,1 н. NaOH. Образуется студенистый осадок гидроксида цинка.

В микропипетку, предварительно сполоснутую раствором оксалата натрия, набирают 0,1 мл крови. Пипетку с кровью погружают до дна в пробирку 1 с гидроксидом цинка, осторожно выдувают кровь и промывают пипетку 2-3 раза путем втягивания и выпускания верхнего слоя жидкости. Таким же образом сухой пипеткой (или той же самой, сполоснутой раствором оксалата натрия) набирают кровь в пробирку 2. Пробирки 3 и 4 - контрольные (без крови). Затем все четыре пробирки помещают в кипящую водяную баню на 3 мин и по истечении этого времени вынимают и ставят в штатив.

Жидкость во всех четырех пробирках фильтруют в заранее пронумерованные сахарные стаканчики через вату, которая кладется в виде маленького плотного кусочка в конус воронок. Вату предварительно промывают дистиллированной горячей водой 3 раза, при этом каждый раз отжимают ее, надавливая ладонью на края воронки. Пробирки, в которых нагревалась кровь, и воронки с ватой после того, как отфильтрована вся жидкость, промывают 3 раза горячей дистиллированной водой по 1-3 мл (вату каждый раз отжимают указанным выше способом).

К фильтрату в каждый стаканчик прибавляют по 2 мл щелочного раствора железосинеродистого калия и пробы нагревают в кипящей водяной бане точно 15 мин (за это время глюкоза полностью окисляется). После охлаждения к жидкости добавляют 3 мл тройного раствора (смесь растворов ZnSO4, NaCI, KI). Содержимое стаканчиков перемешивают взбалтыванием и подкисляют 2 мл 3% уксусной кислоты. Выделившийся иод оттитровывают тиосульфатом натрия (Na2S2O3), используя в качестве индикатора 2 капли 1% раствора крахмала; титруют до исчезновения синей краски.

Чтобы предотвратить образование железосинеродистого калия из железистосинеродистого калия, последний выводится из сферы реакции с помощью сернокислого цинка. Добавление сернокислого цинка приводит к образованию нерастворимой комплексной соли.

Количество сахара в крови вычисляют по данным титрования с помощью эмпирически составленной авторами метода таблицы.

Ввиду того, что ряд соединений неуглеводного характера (мочевая кислота, глютатион и др.) обладают наряду с глюкозой способностью восстанавливать ионы тяжелых и переходных металлов, результаты анализа оказываются завышенными. Ошибка может достигать 10-20%.

Четырехэтапное определение глюкозы с предварительным осаждением белков крови и приготовлением достаточно большого количества титрованных растворов требуют от аналитика значительных затрат времени на подготовку и проведение анализа.

Авторы предлагают быстрый и доступный метод определения глюкозы в ротовой жидкости, имеющий определенные преимущества по сравнению с описанными выше классическими методами.

При значительном сокращении времени проведения анализа для его осуществления не требуется каких-либо редких реактивов и специальных приборов. Анализ выполняют следующим образом:

оборудование и реактивы: водяная баня, лабораторный термометр на 100°С, 2N раствор КОН, 0,1% р-р метиленового синего, градуированные термостойкие пробирки (по числу проб ротовой жидкости), неградуированные пипетки - 2 шт., дистиллированная вода.

Ход определения:

в пробирку набирают 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости, добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2N раствор КОН и 3 капли 0,1%-ного р-ра метиленового синего. Перемешивают встряхиванием и нагревают на водяной бане до ˜80°С (±2°С).

При содержании глюкозы в анализируемом образце>0,12% наблюдается полное исчезновение синей окраски индикатора. При меньшем содержании глюкозы окраска сохраняется.

Заявленным способом было протестировано 50 образцов ротовой жидкости (смешанной слюны), взятых у пациентов стоматологической поликлиники с жалобами на состояние пародонта. Ротовая жидкость собиралась натощак после тщательного прополаскивания ротовой полости дистиллированной водой. Содержание глюкозы, превышающее 0,12%, было обнаружено в смешанной слюне шести пациентов, у которых в дальнейшем при обследовании были обнаружены нарушения функции поджелудочной железы.

Клинический пример №1

Амбулаторная карта №76278. Пациентка Н., 56 лет, обратилась в стоматологическую поликлинику в сентябре 2006 г. с жалобами на состояние пародонта. В образце ротовой жидкости предложенными авторами способом обнаружено повышенное содержание глюкозы (>0,12%).

При дальнейшем обследовании у эндокринолога и в крови пациента было обнаружено содержание сахара, превышающее норму.

Клинический пример №2

Амбулаторная карта №69179. Пациент Т., 47 лет, обратился в стоматологическую поликлинику в сентябре 2006 г. с жалобами на состояние пародонта. Предложенным авторами способом в образце ротовой жидкости не обнаружено превышения содержания глюкозы. Анализ крови, выполненный параллельно с анализом ротовой жидкости, также показал содержание глюкозы в пределах нормы.

Способ определения глюкозы в ротовой жидкости, включающий определение содержания глюкозы в биологической жидкости, отличающийся тем, что к 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2 N раствора КОН и 3 капли 0,1%-ного раствора метиленового синего, перемешивают содержимое встряхиванием и нагревают на водяной бане до 80°С (±2°С) и при сохранении синей окраски индикатора говорят о нормальном содержании глюкозы в ротовой жидкости - менее 0,12%, а при полном исчезновении синей окраски индикатора делают выводы о превышении нормального значения содержания глюкозы в ротовой жидкости.
Все очень просто! По Гиппократу - пища это лекарство. Но не можем же мы постоянно принимать лекарства!
"Есть или не есть и что есть из того, что есть?"
Если ты поднялся на вершину горы и тебе некуда идти - иди дальше!

Нажимай на значок "пальца" в верхнем правом углу и спи крепко.


  • Похожие темы
    Ответов
    Просмотров
    Последнее сообщение

Вернуться в «Анализы свои руками»

Кто сейчас на форуме

Количество пользователей, которые сейчас просматривают этот форум: нет зарегистрированных пользователей и 1 гость